生物素概述和生物素化3種試劑的蛋白質(zhì)標(biāo)記等特性

 

生物素（biotin，B）分子量244．31D．生物素分子有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中Ⅰ環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親和素結(jié)合的主要部位；Ⅱ環(huán)為噻吩環(huán)，C2上有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的結(jié)構(gòu)，經(jīng)化學(xué)修飾后，生物素可成為帶有多種活性基團(tuán)的衍生物——活化生物素。

 

生物素是水溶性B族維生素，以前稱為維生素H或輔酶R。它是羧化酶的輔酶，其與纈氨酸、脂肪酸、異亮氨酸等的合成有關(guān)。

 

連接各種反應(yīng)基團(tuán)的生物素被用來標(biāo)記蛋白質(zhì)或抗體。生物素標(biāo)記的蛋白或抗體可用鏈霉素耦聯(lián)的HRP或磁珠進(jìn)行檢測(cè)或純化。

 

 

二、生物素化試劑包含3種：

 

a. 伯胺反應(yīng)性生物素化試劑

 

伯胺生物素化試劑基于水溶性分為兩組：NHS-酯和磺基-NHS-酯。

 

1.NHS-酯的特點(diǎn)：

 

蛋白質(zhì)標(biāo)記-生物素化抗體或其它蛋白質(zhì)，用于檢測(cè)或純化；

 

細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記-膜滲透性，可用于標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)部；

 

胺反應(yīng)性-與伯胺（-NH2）反應(yīng)，例如賴氨酸的側(cè)鏈或N端伯胺；

 

溶解性-水不溶性，必須溶解在DMSO或DMF中，然后在水溶性緩沖液中進(jìn)一步稀釋。

 

2.磺基-NHS-酯的特點(diǎn)：

 

蛋白質(zhì)標(biāo)記-生物素化抗體，用于固定、純化或檢測(cè)；

 

細(xì)胞表面標(biāo)記-不穿透質(zhì)膜，僅生物素化細(xì)胞的表面蛋白；

 

胺反應(yīng)性-與伯胺（-NH2）反應(yīng)，例如賴氨酸的側(cè)鏈或N端伯胺；

 

溶解性-易溶于水，可用于不能耐受有機(jī)溶劑的應(yīng)用。

 

b. 巰基反應(yīng)性生物素化試劑

 

巰基反應(yīng)性生物素化試劑分為兩類：生物素-HPDP和碘乙酰基-LC-生物素。

 

1.生物素-HPDP的特點(diǎn)：

 

蛋白質(zhì)標(biāo)記-生物素化抗體或其它蛋白質(zhì)；

 

巰基反應(yīng)性-與巰基（-SH）反應(yīng)，例如半胱氨酸（C）的側(cè)鏈；

 

吡啶基二硫醇活化-在pH6.5至7.5的緩沖液如PBS中反應(yīng)；

 

可逆-形成二硫鍵，其可以使用DTT或其它還原劑切割；

 

溶解性-水不溶性，必須溶解在DMSO或DMF中，然后在水溶性緩沖液中進(jìn)一步稀釋。

 

2.碘乙酰基-LC-生物素的特點(diǎn)：

 

蛋白質(zhì)標(biāo)記-生物素化抗體或其它蛋白質(zhì)；

 

細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記-膜可透過，可用于標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)部；

 

巰基反應(yīng)性-與巰基（-SH）反應(yīng)，例如半胱氨酸（C）的側(cè)鏈；

 

碘乙酰激活-反應(yīng)在pH7.5至8.5的Tris或硼酸鹽緩沖液中避光進(jìn)行；

 

不可逆-形成不可逆性硫醚鍵，間隔臂不能被切割；

 

溶解性-水不溶性，必須溶解在DMSO或DMF中，然后在水溶性緩沖液中進(jìn)一步稀釋。

 

c. 羰基反應(yīng)性生物素化試劑

 

生物素-酰肼是通常用于靶向聚糖和糖蛋白的蛋白修飾試劑。

 

生物素-酰肼的特點(diǎn)

 

糖蛋白標(biāo)記-在唾液酸殘基上生物素化糖基化蛋白，用于檢測(cè)或純化；

 

細(xì)胞表面標(biāo)記-生物素化和分離細(xì)胞表面糖蛋白；

 

醛反應(yīng)性-與糖基高碘酸鹽氧化形成的醛反應(yīng)；

 

酰肼活化-在pH值為4~6的緩沖液如乙酸鈉中進(jìn)行反應(yīng)；

 

不可逆的-形成半不可逆性腙鍵；間隔臂不能被切割；

 

溶解性-通常溶于DMSO，然后在水溶性緩沖液中進(jìn)一步稀釋。